本研究生成了 8 名乳腺癌患者的原发肿瘤 (PT) 和配对 LNMT 的单细胞图谱。本研究证明，与 PT 相比，LNMT 中 T 细胞的活化、细胞毒性和增殖受到抑制。
导语：淋巴结转移肿瘤（LNMT）的微环境决定肿瘤的进展和对治疗的反应，但缺乏对LNMT的系统研究。
本研究入组了 8 名未经治疗且经 LNMT 病理诊断为乳腺浸润性导管癌的女性患者。
为了表征乳腺癌患者 PT 和 LNMT 的 TME，本研究收集了 8 名未接受治疗的乳腺癌亚型（包括 Luminal A、Luminal B 和 HER2+）患者的 LNMT 和 PT 配对组织。这些组织被分离成单细胞，使用10x Genomics 5 mRNA和T细胞受体（TCR）测序方法总共获得了118,845个细胞（图1a）。所有细胞根据其典型标记可分为以下9种主要类型：B细胞（CD3D，CD79A），CD4 T细胞（CD3D，CD4），CD8 T细胞（CD3D，CD8A），NK细胞（GNLY） 、骨髓细胞 (LYZ)、上皮细胞 (EPCAM 和 KRT19)、CAF (PDGFRA)、血管周围样 (PVL) 细胞 (RGS5) 和 TEC（PLVAP）。本研究发现，PT 中的细胞类型在不同患者之间差异很大，但 LNMT 中的细胞类型相似。然后，根据细胞的特定标记基因本研究进一步将细胞聚类并注释为40个不同的细胞簇（图1b）。为了研究 PT 和 LNMT 中细胞类型的富集情况，本研究计算了每个簇内组织的百分比。数据显示，B细胞和CD4 T细胞是正常LN的众所周知的细胞成分，在LNMT的微环境中富集。相反，PT 中上皮细胞、CD8 T 细胞、CAF 和肥大细胞富集（图 1c、d）。 PT 和 LNMT 之间细胞类型的差异也显示在 UMAP 嵌入图中，该图根据组织类型着色（图 1e）。为了进一步证明本研究收集的细胞是瘤内的，本研究从本研究的8例患者中随机选取4例患者的淋巴结组织进行空间转录组学。结果显示，4名患者的肿瘤细胞比例均超过50%，其中3名患者的肿瘤细胞比例超过75%，表明样本来自淋巴结转移（图1f）。这些数据表明，LN 转移微环境的细胞类型与 PT 显著不同。
LN 是免疫细胞循环和成熟的核心。为了确定为什么恶性细胞能够在 LN 中存活而不被免疫细胞消灭，本研究分析了 PT 和 LNMT 中免疫细胞的特征。本研究将T细胞和NK细胞注释为15个簇，包括5个CD8 T细胞亚群、7个CD4 T细胞亚群、γδ T细胞和2个NK细胞亚群（图2a）。数据显示，来自两种组织的 T 细胞和 NK 细胞分布不同，并表现出不同的转录程序（图 2a）。
为了追踪 CD8 T 细胞的发育轨迹，本研究采用扩散嵌入图来可视化 CD8 T 子集，并发现了连续的发育进程（图 2b）。CD8-C1-CD8B存在于CD8 T细胞分化的初始阶段，其中CCR7和SELL也高表达（图2b），它们是幼稚T细胞（TN）的标志物。CD8-C2-CCL5的特点是细胞毒性标记物的高表达和HOPX的高表达，出现在CD8-C1-CD8B之后的下一阶段。CCL5+ T细胞进一步分支为CD8-C3-GZMK或CD8-C4-HSPA1A（图2b）。CD8-C3-GZMK 细胞由于表达 NKG7、GZMA 和 GZMK 等细胞毒性标记物而被定义为效应记忆 T 细胞 (TEM)；同时，表达细胞毒性标记物和高水平CD69和低水平ITGAE的CD8-C4-HSP1A1代表CD69+ITGAE-组织驻留记忆T细胞（TRM）（图2b）。CD8-C5-CXCL13从CD8-C3-GZMK分化而来，被认为是分化的终末状态（图2b）。CD8-C5-CXCL13表达细胞毒性标记物和耗尽标记物，包括CTLA4、PDCD1和LAG3，并且被表征为耗尽或预耗尽的CD8 T细胞。然后，本研究进行主成分分析 (PCA) 以研究 LNMT 和 PT 微环境中的 CD8 T 细胞。主成分 (PC) 2 是区分前 20 个 PC 的 PT 和 LNMT 之间 CD8 T 细胞的最显著成分。本研究使用根据组织类型着色的 PCA 嵌入图来确定 CD8 T 细胞的分布（图 2c）。对PC2贡献最大的变异基因是CCL5、CCL4、参与T细胞募集的趋化因子、在抗原呈递中发挥作用的MHC II类基因，以及GZMA和GZMH等细胞因子。CD8 T 细胞激活特征还显示 PT 中的 CD8 T 细胞比 LNMT 中的 CD8 T 细胞具有更高的激活分数（图 2d），支持了之前的发现。
接下来，本研究分析了CD4 T细胞的特性。本研究中，CD4 T 细胞根据其特定的基因表达分为 7 个簇（图 2a）。根据它们的标记，CD4-C1-RPL 对应于初始 CD4 细胞，而 CD4-C2-ANXA1 和 CD4-C3-YPEL5 对应于记忆或前记忆 CD4 细胞。这 3 个簇在 LNMT 中富集（图 2a）。有趣的是，本研究发现两种微环境中的 CD4+ CXCL13+ T 细胞之间存在显著的异质性（图 2e、f）。为了研究 CD4+ CXCL13+ 细胞的异质性，本研究对 CD4+ CXCL13+ T 细胞进行了重新聚类，发现了 5 个 CD4+ CXCL13+ T 细胞簇，通过其典型标记进行识别（图 2g-i）。本研究发现PTs中簇2的百分比远高于LNMTs（图2j）。簇2比其他CD4+CXCL13+簇表达更高水平的干扰素-γ（IFN-γ），表明这种类型的CD4T细胞具有杀死肿瘤细胞的潜在作用（图2i）。本研究发现BHLHE40在簇2中高表达（图2i），这与之前报道的BHLHE40+ CD4+ T细胞具有抑制结肠癌细胞能力的研究一致，支持了肿瘤抑制功能的推测集群 2。相比之下，LNMT 显示更多 GPR183 高表达的簇 1 细胞，据报道 GPR183 在初始 CD4 和 CD8 T 细胞中表达（图 2i）。使用扩散图推断CD4+CXCL13+T细胞轨迹，本研究发现簇1的初始发育阶段可以分化为3个分支：簇2、簇3和簇4（图2g）。本研究发现LNMT中的簇1主要分化为耗尽的簇3，而在PT中，它主要分化为肿瘤抑制簇2（图2k）。簇2和簇3之间的差异基因分析证实，簇2在肿瘤中表达高肿瘤抑制基因（例如GZMA）（图2l）。簇 3 与簇 2 的比率也可用于预测 TCGA-BRCA 数据集中的不良预后（图 2m）。这一发现表明，LNMT 中的 CD4 T 细胞比 PT 和 CD4+ CXCL13+ T 细胞成熟度较低，并且更有可能在 LNMT 中被重编程为耗尽状态。总之，这些数据表明，与 PT 相比，LNMT 中 T 细胞的抗肿瘤细胞毒性降低。
T克隆扩增和转变是免疫反应和免疫激活的表现。因此，本研究通过单细胞分辨率 TCR 测序分析了 CD4 和 CD8 T 细胞中的 T 克隆扩增和转变。捕获了 59,327 个免疫 T 细胞，并对其中 47,803 个进行了 TCR 分析。本研究发现克隆扩增的 PT 中 T 细胞的比例高于 LNMT 中的 T 细胞比例（图 3a）。然后本研究采用基于香农熵的 STARTRAC 方法来量化 T 细胞簇的扩张和转变能力。CD8 T细胞的转变和扩增能力比CD4 T细胞更强大。本研究发现PT中的CD4 T细胞，例如CD4-C3-YPEL5，比LNMT中的CD4 T细胞具有更强的转变能力（图3b）。然后本研究使用 STARTRAC-expansion 来测量每个 T 细胞簇的扩展。CD4-C6-CXCL13 在 CD4 T 细胞中具有最大的扩增能力，其次是 CD4-C5-FOXP3。这两个簇在 PT 中表现出比 LNMT 更大的扩展能力（图 3c）。CD8-C2-CCL5和CD8-C3-GZMK在PT中表现出比LNMT中更强大的扩展能力（图3c）。基于TCR测序分析，本研究将CD4调节性T细胞(Tregs)评分和CD8活化评分与不同组织中每个簇的细胞扩增分别拟合，以确定T细胞活化与TCR扩增之间的相关性。即使处于相似的发育阶段，T 细胞在 LNMT 中的扩增能力也比在 PT 中弱（图 3d、e）。总体而言，CD4和CD8 T细胞的TCR测序分析进一步证明，T细胞在LNMT中表现出比PT中更低的扩增和转变活性。
为了进一步证明 T 细胞在 LNMT 中受到抑制，本研究比较了 LNMT 中与 PT 中匹配的 T (MT) 细胞的活性。位于2个不同组织中具有相同TCR的T细胞被认为是MT细胞，源自相同的祖细胞并具有相似的发育时间（图4a）。结果表明，PTs 的微环境中 MT 细胞的比例 (25%) 高于 LNMTs (5.8%)（图 4b）。匹配的T细胞仅占T细胞总数的25%以下（图4b），并且可以在不同的状态之间转换。为了避免遗漏匹配T不同状态造成的差异，本研究将所有匹配的CD8 T纳入DEG分析，并将匹配的CD4 T细胞分离为常规CD4 T（Tconvs）和Tregs进行差异基因分析。结果显示，与PT相比，LNMT的匹配CD8 T细胞中有128个基因显著下调，63个基因上调（图4c）。然后将这些重要基因投入通路富集分析，以揭示潜在的生物学功能。本研究发现LNMT中扩增的CD8 T细胞的下调基因在T细胞活化中富集，这也反映出LNMT中的T细胞活性低于PT（图4d）。对于CD4 T细胞，与PT相比，LNMT的匹配Tconv中460个基因显著下调，21个基因上调（图4e）。通路富集分析显示，PT 中的 Tconv 在 T 细胞激活通路和细胞因子产生的正向调节中富集（图 4f ）。至于Tregs，与PT相比，LNMT的匹配Tregs中只有27个基因下调，16个基因上调。总之，这些数据进一步支持 T 细胞在 LNMT 中的激活程度低于 PT。
差异基因分析显示，PT中的DC在干扰素刺激基因（ISG15）中更富集，并且具有更高水平的STAT1表达（图5d），这是DC分化和成熟的关键转录。此外，PT中的DC-C3-LAMP3比LNMT中的MHC II基因表达更高（图5e，f）。由于活化的 DC 在与其他免疫细胞的通讯中发挥着重要作用，因此本研究随后着手确定 DC-C3-LAMP3 是否表现出与免疫细胞不同类型的通讯，具体取决于它是在 PT 还是 LNMT 中。LAMP3+ DC在PT中高表达CXCL9和CCL19，在LNMT中高表达CCL17和CCL22（图5g）。细胞-细胞相互作用分析表明，与 LNMT 中相比，PT 中的 LAMP3+ DC 通过 CXCL9:CXCR3、CCL19:CXCR3 或 CCL19:CCR7 与免疫细胞表现出更大的相互作用。然而，LNMT中的LAMP3+ DC通过CCL17:CCR4和CCL22:CCR4表现出与Treg更强的相互作用（图5h），这表明LNMT中的LAMP3+ DC可能更有可能招募和激活Treg以增强免疫抑制。这些数据表明，PT 中的 DC，尤其是 LAMP3+ DC，比 LNMT 中的 DC 更成熟，并且具有更强的 T 细胞启动和激活能力。
CD68 高表达的亚群被定义为巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 的特点是在 TME 中富集。本研究将已发表的研究数据与本研究的单细胞分析数据相结合，以阐明组织驻留巨噬细胞亚群的特性。 与之前的研究一致，本研究发现 TME 中的巨噬细胞表现出更大程度的多样性和复杂性。Macro-C4-CXCL11 和 Macro-C5-SPP1 在 TME 中显著高度富集，并且与 TAM 相对应。Macro-C1APOC1、Macro-C2-SLC40A1和Macro-C6-CCL3被定义为组织驻留巨噬细胞，其在肿瘤中的水平与邻近组织中的水平相当（图5i）。众所周知，M1 和 M2 特征代表肿瘤中巨噬细胞的不同功能。在这项研究中，本研究发现与 LNMT 相比，PT 中这 2 种巨噬细胞的比例没有差异。然而，通过差异基因分析，本研究发现巨噬细胞在PT中比LNMT中具有更高的IFI27、IFITM1和IFI44L表达（图5j），表明PT中IFN-γ信号传导被激活。
在本研究的数据集中，确定了 3 种类型的基质细胞：TEC、PVL 和 CAF（图 6a）。PVL包括2个亚型，PVLC1-MGS5和PVL-C2-MYH11，两者均表现出肌动蛋白细胞骨架基因ACTA2和GTPase激活蛋白RGS5的高表达。CAF 在癌症微环境中发挥着关键作用，可能抑制免疫反应和/或促进肿瘤转移。本研究发现 PT 与 LNMT 中总 CAF 的比例没有差异（图 1d）。根据其差异共表达标记，成纤维细胞进一步分为3种CAF类型：肌成纤维细胞样表型（mCAF），包括CAF-C1-POSTN；2种炎症性成纤维细胞（iCAF），包括CAF-C2-APOD和CAF-C3-PLA2G2A（图6a）。
重要的是，本研究发现CAF-C3-PLA2G2A在HER2+肿瘤中出现频率较高，而CAF-C2-APOD在管腔肿瘤中富集（图6b，c）。与管腔乳腺癌相比，HER2+肿瘤具有高度的免疫浸润，该亚型患者可以从免疫治疗中受益。因此，本研究的目的是确定 HER2+ 肿瘤中 CAF-C3-PLA2G2A 的富集是否与免疫浸润有关。通过细胞-细胞相互作用分析，本研究发现，与其他两种类型的成纤维细胞相比，CAF-C3-PLA2G2A与免疫细胞（包括CD4和CD8 T细胞、DC和巨噬细胞）表现出更强的相互作用（图6d） 。从机制上讲，PLA2G2A：α4β1整合素、OGN：HLA-DRB1、VSIR：CCL4L2、FN1：α4β1整合素和DPP4：CCL3L1相互作用复合物被发现负责PLA2GA+CAF与免疫细胞的关联。据报道，HLA-DRB1、α4β1 整合素、CCL4L2 和 CCL3L1 在免疫细胞中表达。在本研究中发现CAF-C3-PLA2G2A还表现出丰富的OGN、VSIR、FN1和DPP4表达，它们可以与免疫细胞相互作用。相反，CAF-C2-APOD中OGN、VSIR、FN1和DPP4的基因表达要低得多（图6d，e）。为了进一步验证PLA2G2A+ CAF在免疫细胞中的功能，本研究用PLA2G2A蛋白处理单核THP1细胞，发现PLA2G2A可以促进THP1细胞的迁移（图6f）。这些数据表明 PLA2GA+ CAF 具有吸引免疫细胞的潜力。
此外，本研究发现仅在 PLA2G2A+ CAF 中表达的 PLA2G2A在 HER2+ 患者中高表达，并且与 TCGA-BRCA 数据集中的免疫细胞标记物 CD3E 高度相关（图 6g）。在乳腺癌患者中，PLA2G2A 还与 CD45 抗原 PTPRC、B 细胞标记物 CD79A 和 CD8 T 细胞标记物 CD8A 呈正相关。人乳腺癌组织中的免疫组织化学（IHC）染色进一步显示，HER2+肿瘤中的PLA2G2A+ CAF比管腔肿瘤中的PLA2G2A+ CAF更丰富（图6h，i）。免疫荧光分析还表明，PLA2G2A+ CAF与巨噬细胞和CD8 T细胞具有相似的空间分布（图6j），并在单细胞水平上证实了PLA2G2A+ CAF与巨噬细胞和CD8 T细胞的相互作用（图6k）。简而言之，本研究在乳腺癌患者中鉴定了3个CAF亚群，并证明了HER2+肿瘤中PLA2G2A+ CAF的富集，这些可能是决定乳腺癌免疫浸润的主要微环境因素。
最后，本研究想要表征恶性上皮细胞的特征。上皮细胞根据CNV分为恶性上皮细胞和非恶性上皮细胞。根据上皮细胞恶性评分的分布将恶性细胞和非恶性细胞分开。患者之间的 CNV 热图表现出相当大的差异，即使在不同的组织中，同一患者中也观察到相似的模式。来自同一患者的恶性细胞表现出相似的CNV模式，表明恶性细胞来自同一起源点（图7a，b）。
为了进一步了解淋巴结转移恶性细胞的特征，本研究比较了每个组织中至少有 20 个细胞的患者的 LNMT 和 PT 之间的恶性细胞的转录组特征。因此，排除了 3 名患者，并计算了其他 5 名患者的转录组特征。患者之间几乎没有共享的重要基因。本研究发现与患者8的PT相比，抗原呈递基因，如CD74、HLA-DRA和B2M，在LNMT中大多下调（图7c）。同样，本研究还发现患者 5 的 LNMT 中 HLA-B 和 HLA-C 下调。为了表征这些发现是否普遍存在于大多数患者中，来自 5 名患者的转录组特征被用于 GSEA 富集分析。分析了 5 名患者共有的重要通路，并对每个通路的标准化富集评分 (NES) 进行了平均。然后根据共享患者的数量和 NES 平均值对通路进行排名。在前 10 个富集通路中，有 4 个通路与抗原呈递相关，并且这些通路在 5 名患者中的 4 名中富集（图 7d、e）。
本研究发现，下调的抗原呈递通路是否与恶性细胞的 CNV 克隆有关。然后，本研究根据每位患者的 CNV 相似性对恶性细胞进行聚类，然后比较 PT 与 LNMT 中每个 CNV 克隆的 DEG （图 7f）。本研究发现患者8中属于不同CNV簇的恶性细胞在转移能力上没有差异（图7g）。抗原呈递基因主要可分为MHC I类和MHC II类分子。本研究比较了不同CNV簇中PT和LNMT中两种类型的抗原呈递，发现MHC I和MHC II类分子在患者8的不同CNV簇中的LNMT中下调（图7h）。这些发现表明，迁移到 LNMT 的恶性细胞可能会产生较低的抗原呈递基因，从而产生免疫逃避机制，这为了解乳腺癌恶性细胞转移的特征提供了见解。
本研究生成了 8 名乳腺癌患者的原发肿瘤 (PT) 和配对 LNMT 的单细胞图谱。本研究证明，与 PT 相比，LNMT 中 T 细胞的活化、细胞毒性和增殖受到抑制。LNMT 中的 CD4+ CXCL13+ T 细胞更有可能分化为衰竭状态。有趣的是，LNMT 中的 LAMP3+ 树突状细胞表现出比 PT 中更低的 T 细胞启动和激活能力。此外，本研究还发现了一种在 HER2+ 乳腺癌患者体内富集的 PLA2G2A+ 癌症相关成纤维细胞亚型，可促进免疫浸润。本研究还表明，抗原呈递通路在转移淋巴结的恶性细胞中下调。总之，本研究描述了 LNMT 和 PT 的微环境，这可能有助于乳腺癌淋巴结转移患者的个体化治疗策略。